Visualisierung von Zellen und Nanopartikeln
Für eine umfassende Analyse möglicher Schadwirkungen von Nanopartikeln auf Mensch und Umwelt ist es von großem Interesse, mögliche Aufnahmewege in die Zelle, aber auch die mögliche subzelluläre Verteilung von Nanopartikeln aufzuklären. Da – entsprechend der Definition der britischen Royal Society & The Royal Academy of Engineering (2004) – der Größenbereich solcher „Nanopartikel“ in einer Dimension unter 100 nm (1 nm = ein milliardstel Meter) liegt, ist eine Visualisierung solcher Nanopartikel nur mit Hilfe spezieller mikroskopischer Verfahren möglich. Eine direkte, bildgebende Darstellung ist allerdings der Elektronenmikroskopie (EM) vorbehalten. Damit können sowohl die Partikel alleine, als auch in Verbindung mit organischem Material bis hin zu Zellen und Geweben untersucht werden. Letztgenanntes macht die EM-Techniken auch in Hinblick auf Untersuchungen der möglichen Auswirkungen solcher Nanopartikel (und Nanopartikel enthaltener Produkte) auf biologische Systeme zu einem besonderen Hilfsmittel. Es können damit eine mögliche Aufnahme und Verteilung innerhalb von Geweben, Zellen und deren Organellen untersucht werden. Allerdings erfordert die EM eine spezielle, in vielen Fällen aufwendige und langwierige Probenpräparation, die bei der Beurteilung der Daten immer berücksichtigt werden muss.
Bei dem vom BMBF geförderten Projekt INOS werden daher von uns sowohl die Ausgangsmaterialien (z. B. metallische und/oder keramische Nanopartikel, Kohlenstoffnanoröhren) für sich alleine, als auch damit behandelte Zellen aus Zellkulturversuchen untersucht. Neben der morphologischen Charakterisierung der Nanopartikel nimmt dabei die Visualisierung und einwandfreie Identifizierung von Nanopartikeln und deren Agglomeraten an oder in Zellen eine zentrale Rolle ein.
Dazu werden von uns rasterelektronenmikroskopische (REM) und transsmissionselektronenmikroskopische (TEM) Methoden eingesetzt:
REM Methoden:
Präparation von Zellen aus Zellkulturen: Auf Zellkulturplättchen aufgewachsene Zellen werden mit Glutaraldehyd fixiert, mit Aceton entwässert, am kritischen Punkt getrocknet, mit Kohlenstoff beschichtet (im Vakuum) und anschließend im REM unter Verwendung unterschiedlicher Detektorsysteme analysiert. Dabei liefert der Sekundärelektronendetektor hauptsächlich Informationen zur Topologie der Probe, wohingegen der Rückstreuelektronendetektor vor allem Informationen über die Materialbeschaffenheit (Ordnungszahl der enthaltenen Elemente) liefert. Mit Hilfe der Energiedispersiven Röntgenstrahl-Analyse (EDX = Energy Dispersive X-ray Analysis) kann auch die elementare Zusammensetzung von ausgesuchten Bereichen der Proben analysiert werden.
TEM Methoden:
Genügend kleine Proben (Zellpellets, Gewebestückchen, in Agar eingeschlossenes Nanopartikelpulver etc.) werden mit Glutaraldehyd fixiert, mit Osmiumtetroxid und Uranylacetat postfixiert/kontrastiert, mit Aceton entwässert, mit Epoxidharz infiltriert und unter Wärmebehandlung ausgehärtet. Nach dem Anfertigen von Ultradünnschnitten (ca. 50 nm Dicke) mittels Ultramikrotom werden die Schnitte auf Netzchen aufgebracht, mit Uranylacetat/Bleicitrat nachkontrastiert und in einem TEM analysiert.
Die geschnittenen Epoxidharzblöckchen können nach Montage auf REM-Träger und Beschichten mit Kohlenstoff auch im REM untersucht werden (v. a. mit dem Rüchstreuelektronendetektor).
Mit den so erzielten Informationen und Daten leisten wir einen wichtigen Beitrag zur Interpretation der toxikologischen Ergebnisse unserer Verbundpartner vom Helmholz-Zentrum für Umweltforschung (UFZ; Leipzig) und dem Universitätsklinikum Dresden und – im Falle der Charakterisierung der Ausgangsmaterialien – einen Beitrag zu den Befunden des Fraunhofer Instituts für Keramische Technologien und Systeme (IKTS; Dresden) und der NAMOS GmbH (Dresden).
Ansprechpartner:
Dr. Michael Gelinsky, Technische Universität Dresden, Max-Bergmann-Zentrum für Biomaterialien/Institut für Werkstoffwissenschaft, Budapesterstrasse 27, D-01069 Desden
Tel. ++49/(0)351/463-39370, Fax: -39401
Mail: michael.gelinsky@tu-dresden.de
Dr. Armin Springer, Technische Universität Dresden, Max-Bergmann-Zentrum für Biomaterialien/Institut für Werkstoffwissenschaft, Budapesterstrasse 27, D-01069 Desden
Tel. ++49/(0)351/463-39371, Fax: -39401
Mail: armin.springer@nano.tu-dresden.de